Документация
Все о Биофоне Лечение Покупка Новости Вопросы-ответы

Государственный научный центр прикладной микробиологии, научно-производственный отдел генно-инженерных препаратов (п.Оболенск).

Научно-исследовательский отчет о результатах экспериментов по изучению воздействия аппарата "Биофон" на микроорганизмы Pseudomonas aerughinosa и Staphylococcus aureus

Срок проведения экспериментов: 17-28 мая 1998 г.

Целью работы являлось проведение экспериментов по изучению воздействия приборов "Биофон" на 2 штамма микроорганизмов Pseudomonas aerughinosa и Staphylococcus aureus.

Для определения воздействия приборов "Биофон" на данные штаммы микроорганизмов проводились следующие эксперименты:

1.Оценка влияния приборов на жизнеспособность Ps. и St.

Для определения жизнеспособности штаммов проводился подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов обработанных и необработанных прибором. Для этого суточную суспензию микроорганизмов выращенную при 37oС на LB бульоне (при непрерывном "качании"), затем делили на две части, одну из которых обрабатывали прибором, а другую использовали как контроль. После раститровки (разведени я) для Ps. 8 разведений и для St. 6 разведений полученной суспензией засевали чашки с LB агаром и помещали в термостат при температуре 37oС. Учет проводился для Ps. через 20 часов, а для St. через 44 часа (степень разведения и время учета были определены предварительно экспериментальным путем). Полученные результаты свидетельствуют, что обработка прибором снижает число КОЕ у Ps. в 10-15 раз, а у St. на 20-25%. Обработка прибором уменьшала также и размер колоний, у Ps. в 3-4 раза, у St. в 1-2 раза.

2.Определение жизнспособности штаммов микроорганизмов по времни удвония числа клток в жидкой среде.

Для оценки времени удвоения числа клеток микроорганизмов что характеризует нарастание биомассы соответствующего микроорганизма и, следовательно его физиологическую активность) в жидкой среде, готовили суспензию клеток микроорганизмов в LB бульоне с оптической плотностью 0,2. Оптическая плотность измерялась для суспензии помещенной в 1 см кювету при длине волны 540 нм спектрофотометром Ultraspect-2 (фирма LKB). Суспензию с исходной оптичской плотностью 0,2 помещали по 25 мл в колбы и выращивали при температуре 37o при непрерывном "качании". Определение оптической плотности велось каждый час в отбираемой аликвоте (части всей суспензии).

Полученные данные показали, что время удвоения биомассы у Ps. обработанного прибором составляет 2,15-2,20 часа, у необработанного 1,7-1,8 часа. У St. 2,5-3 часа (опыт) и 2,3-2,4 часа (контроль) соответственно. При интерпретации данных полученных в результате эксперимента исходили из того, что прирост оптической плотности прямо пропорционален росту биомассы микроорганизма.

З. Определение проницамости мембран микроорганизмов по вытеканию УФ -поглощающих веществ из клеток до и после обработки прибором.

Для оценки биологической функции мембран проводились измерения утечки УФ - поглощающих веществ до и после обработки прибором "Биофон". Известно, что при некоторых сублетальных для микроорганизмов воздействиях (прогрев, голодание, возд. низких температур), клетки теряют пул (определенную часть) низкомолекулярных веществ поглощающих УФ при 260нм (аминокислоты, нуклеотиды, низкомолекулярные белки, витамины). Полученную суспензию микроорганизмов Ps. и St. обрабатывали прибором, затем осаждали при 6000 J на центрифуге (Нitасhi) и определяли в супернатанте (надосадочной жидкости) поглощение УФ.

В результате эксперимента получены следующие данные: при обработке прибором Ps. оптическая плотность увеличилась с 0,385 (контроль) до 2,388 (опыт), у St. соответственно увеличилась с 0,273 (контроль) до 0,423 (опыт). Таким образом, выявлено увеличение вытекания УФ-поглощающих веществ после обработки прибором у Ps. примерно в 6 раз, а у St. примерно на 60%. Определение оптической плотности велось на спектрофотометре Ultraspect-2 (LKB).

4. 0ценка барьерной функции мембран микроорганизмов до и после обработки прибором "Биофон".

Основой метода по оценке барьерной функции мембран является определение флюоресценции этиди й бромида после его проникновения через мембрану внутрь клетки микроорганизма. Для этого к суспензии микроорганизма добавляли этидий бромид до концентрации 5•10-6 моля и регистрировали флюоресценцию на спектрофлуориметре Hitachi-650. В растворах квантовый выход люминесценции этидиума бромида крайне мал и, поэтому, интенсивность люминесценции его слаба. При связывании этидиума бромида с нуклеиновыми кислотами наблюдается резкое увеличение квантового выхода и струк туры клетки содержащие нуклеиновые кислоты приобретают ярко-малиновую - красную люминесценцию с максимумом излучения на длинах волн 590-610 нм.

Полученные в результате эксперим ента данные показывают , что в результат е обработки прибором интенсивность флюоресценции у Ps. возрастает по отношению к контролю на 20-30%, а у St. соответственно на 10-12 % , что свидетел ь ствует о нарушении бар ь ерной функции мембран микроорганизмов.

5. Определение воздействия прибора Биофон на интенсивность дыхания м икроорганизмов.

Учитывая то, что интенсивность процесса дыхания напрямую связана с физиологической активностью микроорганизмов, определение данного параметра является чрезвычайно важным для оценки состояния микроорганизма в целом. О интенсивности дыхания судили по изменению окраски добавляемого в суспензию микроорганизмов красителя метиленового синего (обесцвечивание суспензии с добавлением метиленового синего говорит о его восстановлении дегидрогеназами микроорганизмов, т.е. о интенсивности дыхания данного м ик р о орган и зма). Д ля экспериментов использовали 6-7 часовую культуру микроорганизмов, для чего инокулят помещали в LB бульон и выращивали на "качалке" при температуре 37ё С до оптической плотности 2-2,5 (определение оптической плотности велось при длине волны 540 нм на спектрофотометре Ultraspect-2 (L K B) в 1см кювете). Затем к суспензии микроорганизмов добавляли метиленовый синий (в предварительно найденной опытным путем концентрации) до оптической плотности 1 при 650 нм ( за нулевой показатель в данном случае бралась суспензия микроорганизмов без добавления метиленового синего). Регистрация изменения оптической плотности велась в течении 30 минут - каждые 5 минут. В отдел ь ном эксперименте добавляли глюкозу до конечной концентрации 0,5% для выяснения влияния на показания обеднения среды. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Ps. интенсивно обесцвечивает краситель как с глюкозой, так и без нее, St. практически не восстанавливает краситель без добавления глюкозы. После обработки аликвоты суспензии микроорганизмов прибором интенсивность дыхания Ps. снизилась на 40-50%, а у St. соответственно на 10-15 %.

6. Определение специфичности воздействия приборов на данные микроорганизмы.

Для определения специфичности воздействия приборов на данные штаммы микроорганизмов, был проведен эксперимент по определению воздейс т вия прибора на St. на число КОЕ у Ps. Полученные в результате эксперимента данные свидетельствуют о том, что прибор на St. Снижае т ( в результате воздействия) число КОЕ у Ps. в 3 раза и размер колоний в 2-3 раза.

Примечание: Значительное расхо ж дение между данными по воздействию соответствующих приборов на штаммы Ps. и St. можно объяснить недостаточно адекватной средой и отсутствием предварительных экс п ериментов по определению времени фазы наиболее подходящей для экспериментов (при культивировании St.).

 

Старший научный сотрудник НПП "Бионикс" Копытов Е.Б.

Старший научный сотрудник ГНЦ ПМ Байдусь А.Н.

Старший научный сотрудник ГНЦ ПМ Борисов Н.В.

Лаборант ГНЦ ПМ Герасимова А.К.


Все о Биофоне Лечение Покупка Новости Вопросы-ответы

web@biofon.ru © НПП "Бионикс" 1992-2012 г.