Документация
Все о Биофоне Лечение Покупка Новости Вопросы-ответы

Отчет о результатах исследований по теме:

1 этап: "Исследование влияния воздействия аппарата "Уро-Биофон" на функциональную активность системы комплемента и гетерофильных антител сыворотки крови человека в условиях in vitro и in vivo".

Список исполнителей

1. Шойбонов Б.Б. - к.х.н., с.н.с. клинико-диагностической лаборатории Московского областного НИИ Акушерства и Гинекологии

2. Румш Л.Д. - профессор, д.х.н., заведующий лабораторией химии протеолитических ферментов Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

3. Сониев В.М. - аспирант лаборатории молекулярной иммунологии МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского

4. Шойбонова Б.В. - аспирант лаборатории молекулярной иммунологии МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского

Содержание

Введение

1. Цель работы

2. Материалы и методы исследования

3. Результаты

4. Заключение

5. Литература

Введение

Система комплемента (СК) состоит более чем из 30 сывороточных и мембранных белков, включая позитивные и негативные регуляторы, является частью иммунной системы и играет ключевую роль как в иммунном ответе на инфекционные агенты, вирус-инфицированные и опухолевые клетки, так и в растворении и элиминации иммунных комплексов. Активация СК генерирует биологически активные анафилатоксины (С3а, С4а и С5а) и мембраноатакующий комплекс (С5b-9), которые опосредуют воспалительные активности, включая хемотаксис, активацию макрофагов, нейтрофилов, тромбоцитов, тучных клеток, повышение сосудистой проницаемости, цитолиз и повреждение тканей (Volonakis and Frank, 1998).

С одной стороны, при пониженной активности или СК, или комплемент активирующей активности иммуноглобулинов нарушается солюбилизация и элиминация циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), что в конечном итоге приводит к аутоиммунным заболеваниям (Lambris and Holers, 2000). С другой стороны, при низкой активности комплемента резко снижается интенсивность процессов регенерации органов и тканей (Sahu and Lambris, 2000).

В связи с этим, разработанный нами метод оценки нарушения иммунного статуса человека позволяет комплексно исследовать цепь событий: Гетерофильные антитела - Иммунный комплекс - Активация системы комплемента - Элиминация ЦИК (Патент РФ № 2002134063, приоритет от 18.12.2002 г.).

Данный метод апробирован в Институте ревматологии, НЦ Сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева и Московском областном НИИ акушерства и гинекологии. Полученные данные свидетельствуют:

1. У больных с ревматоидным артритом и системной красной волчанкой наблюдается резкое увеличение титра (1:1024) гетерофильных антител, а у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями титр ГА доходит до 1:4096 (норма 1:16);

2. У больных с ревматоидным артритом резко снижена активность системы комплемента;

3. Расчет коэффициента комплемент активирующей функции гетерофильных антител дает значение от 0,015 до 2,63 (норма 5,27±0,22);

4. Определение содержания относительного уровня ЦИК свидетельствует о повышении доли "низкомолекулярных" комплексов, обладающих высоким патологическим потенциалом;

5. У беременных женщин снижение коэффициента комплемент активирующей функции выявило четкую связь с хроническими вирусными инфекциями (ВПГ 1,2, ЦМВ, ВЭБ).

2. Цель работы

Целью настоящего исследования явилось углубленное исследование воздействия аппарата ИК-терапии "Уро-Биофон" на состояние системы комплемента, комплемент активирующую функцию гетерофильных антител, комплемент активирующие свойства ЦИК и уровень содержания ЦИК.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование воздействия аппарата ИК-терапии "Уро-Биофон" на функциональную активность системы комплемента в условиях in vitro.

2. Исследование воздействия аппарата ИК-терапии "Уро-Биофон" на эффекторную функцию гетерофильных антител в условиях in vitro.

3. Исследование воздействия аппарата ИК-терапии "Уро-Биофон" на состояние системы комплемента крови человека в условиях in vivo.

4. Исследование воздействия аппарата ИК-терапии "Уро-Биофон" на функциональную активность и содержание гетерофильных антител крови человека в условиях in vivo.

5. Исследование содержания и комплемент активирующей активности циркулирующих иммунных комплексов до и после воздействия аппарата "Уро-Биофон" на организм человека.

3. Материалы и методы исследования

В работе использовали 5,5-диэтилбарбитуровую кислоту (веронал) и ее натриевую соль (мединал), азид натрия - фирмы "Serva" (ФРГ), ЭДТА - "Sigma" (США), остальные реактивы (квалификация не ниже ч.д.а.) отечественного производства.

Приготовление эритроцитов барана, сенсибилизированных эритроцитов барана (ЕА), изотонического вероналового буфера (VBS), буфера, содержащего ионы Са2+ и Мg2+ (VBS2+), описано в работе (Козлов Л.В. и др., 1982).

Определение активности комплемента сыворотки крови человека по гемолизу ЕА. 200 мкл ЕА (1,5?108 кл/мл) инкубировали с 2 мкл сыворотки крови человека в общем объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS2+ (концентрация сыворотки 0,4%). Одновременно ставили контроль на спонтанный гемолиз ЕА (200 мкл ЕА + 300 мкл VBS2+) и контроль на полный лизис (200 мкл ЕА + 300 мкл Н2О). Пробирки встряхивали и инкубировали 30 мин при 37оС. После инкубации в каждую пробу добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли степень гемолиза по величине А412 супернатанта.

Определение титра гетерофильных антител к эритроцитам барана. Для исключения иммунного гемолиза, исследуемые сыворотки декомплементировали, прогревая 30 мин при 56оС. Реакцию гемагглютинации (РГА) ставили в стандартных пластиковых 96-луночных микроплашках с круглодонными лунками. Во все лунки вносили по 40 мкл 0,15 М раствора NaCl и готовили серии двукратных разведений сывороток. Затем вносили по 40 мкл стандартизированной суспензии эритроцитов барана (1,5?108 кл/мл) и перемешивали содержимое лунок путем осторожного встряхивания панели в горизонтальной плоскости. Панель, прикрытую сверху стеклянной пластинкой, выдерживают 30 мин при 37оС. Результаты реакции учитывали невооруженным глазом, определяли последнее разведение сыворотки, в котором еще произошла гемагглютинация. Контроль эритроцитов не содержал сыворотки.

Определение комплемент активирующей функции гетерофильных антител (ГА). 200 мкл Е (1,5?108 кл/мл) инкубировали с 4 мкл сыворотки крови человека в общем объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS2+ (концентрация сыворотки 0,8%). Одновременно ставили контроль на спонтанный гемолиз Е (200 мкл Е + 300 мкл VBS2+) и контроль на полный лизис (200 мкл Е + 300 мкл Н2О). Пробирки встряхивали и инкубировали 30 мин при 37оС. После инкубации определяли степень лизиса, как описано выше.

Определение коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по активации системы комплемента (К ЭФГА-СК). Комплемент активирующую функцию ГА определяли как описано выше. Для учета степени лизиса (У) использовали формулу:

У (%) = [(X-R)/(H-R)?100],

где H, R и X-величины оптической плотности при А412 гемолитической системы при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса Е и в опытной пробе соответственно. Для определения величины (КЭФГА-СК) использовали формулу:

КЭФГА-СК = У / ТГА ,

где У - степень лизиса, %, ТГА - обратный титр гетерофильных антител к эритроцитам барана.

Определение циркулирующих иммунных комплексов проводили по инструкции к набору реагентов "Микроанализ ЦИК" АО "НПО СИНТЕКО", г. Москва. Перед использованием компоненты набора находились при комнатной температуре (25ОС). К 200 мкл "Реагент 1" добавляли 100 мкл сыворотки и тщательно перемешивали. По 100 мкл разведенной сыворотки переносили в 2 пробирки, добавляли в них 0,9 мл "Реагент 1" и 0,9 мл "Реагент 2". Инкубировали обе пробирки при 25ОС в течение 60 мин. Проводили измерение при длине волны 450 нм в см кювете. Значение Е "контроль" вычитали из Е "опыт" пробы. Оперировали величиной Е?1000, где Е = Е "опыт" - Е "контроль". Нормальная величина ЦИК в крови человека - до 55 у.е.

Модифицированный Полиэтиленгликоль-комплемент потребляющий тест (мПЭГ-КПТ). Сущность модификации теста заключается: 1). В повышении концентрации ПЭГ 6000 с 3,5% до 6,67% для преципитации из сыворотки крови человека "среднемолекулярных" и "низкомлекулярных" ЦИК; 2). В качестве источника комплемента вместо комплемента морской свинки использовали аутологичный комплемент сыворотки крови одного и того же человека, взятой до лечения и после курса лечения аппаратом "Уро-Биофон".

мПЭГ-КПТ проводили следующим образом. К 100 мкл сыворотки крови человека добавляли 200 мкл 10% ПЭГ 6000, инкубировали в течение 18 ч при 4оС, центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, декантировали. Осадок промывали 6,67% раствором ПЭГ 6000, центрифугировали. Полученный осадок растворяли в 100 мкл 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,02% NaN3, в течение 1 ч при 37оС. Приготовленный ПЭГосадок использовали в тесте потребления комплемента.

Тест потребления комплемента (ТПК) проводили следующим образом. 5-50 мкл ПЭГ осадка, разведенного 1:99, инкубировали с 2 мкл сыворотки крови человека в течение 20 мин при 37оС в общем объеме 300 мкл, доведенном буфером VBS2+. После инкубации добавляли 200 мкл эритроцитов барана (1,5?108 кл/мл), сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) и продолжали инкубацию в течение 30 мин при 37оС. Степень лизиса определяли как описано выше. Контрольные пробы не содержали ПЭГ осадка.

4. Результаты

1.Исследование воздействия аппарата "Уро-Биофон" на функциональную активность системы комплемента.

По 200 мкл сыворотки крови человека было разлито в пробирки и подвергнуты воздействию аппарата "Уро-Биофон" (1 сеанс). Контрольные образцы находились в другом помещении. Результаты исследования представлены на таблице 1.

Таблица 1. Активность СК до и после воздействия аппарата "Уро-Биофон" in vitro

Образец Активность СК до воздействия, % Активность СК после воздействия, %
Сыворотка 100% 47%

Таким образом, после 1 сеанса воздействия мы наблюдаем снижение активности системы комплемента почти в 2 раза. Разброс системы в данных экспериментах составляет ±5%.

2. Влияние воздействия аппарата "Уро-Биофон" на комплемент активирующую функцию гетерофильных антител в условиях in vitro

Условия эксперимента аналогичны предыдущим исследованиям. Для определения комплемент активирующей функции гетерофильных антител использовали эритроциты барана, не сенсибилизированные антителами кролика. В данной системе эритроциты барана сенсибилизируются гетерофильными антителами (ГА) из сыворотки крови человека. В системе лимитирующим является концентрация ГА, а комплемент (сыворотка) используется в концентрации 0,8%. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Комплемент активирующие свойства ГА до и после воздействия аппарата "Уро-Биофон" in vitro

Образец Активность ГА до воздействия, % Активность ГА после воздействия, %
Сыворотка 100% 43%

Таким образом, после 1 сеанса воздействия аппарата "Уро-Биофон" наблюдается снижение комплемент активирующей функции ГА в два раза.

3. Исследование влияния воздействия аппарата "Уро-Биофон" на активность системы комплемента в условиях in vivo

Исследование активности СК до и после проведенного курса лечения аппаратом "Уро-Биофон" проводили с 24 июня 2003 г по 5 июля 2004 г. Было проведено лечение в январе-феврале месяцах 2004 г. Всего 30 сеансов 1 раз в день. Результаты представлены на таблице 3.

Таблица 3. Активность СК в сыворотке крови до, в период и после воздействия аппарата "Уро-Биофон" на организм человека

Образец Активность системы комплемента, %
Сыворотка 24.04.2003 23.01.2004 7.03.2004 26.04.2004 16.05.2004 5.07.2004
35% 37% 55% 42% 42% 60%

Как видно из таблицы 3, после проведенного курса терапии наблюдается повышение активности СК с 35% до 60%. Активность СК в норме колеблется в пределах 56-68%.

Таким образом, после проведенного курса лечения нормализуется функциональная активность системы комплемента.

4. Исследование влияния воздействия аппарата "Уро-Биофон" на функциональную активность и содержание гетерофильных антител в сыворотке крови человека в условиях in vivo

Функциональную активность и содержание гетерофильных антител определяли параллельно с определением активности СК. Условия проведения тестов подробно описаны в разделе "Материалы и методы". Результаты исследования представлены на таблице 4.

Таблица 4. Содержание и комплемент активирующая функция гетерофильных антител (КАФГА) до, в период и после воздействия аппарата "Уро-Биофон" на организм человека

Дата исследования
24.06.2003 24.01.2004 26.04.2004 16.05.2004 5.07.2004
Титр ГА 1:32 1:64 1:256 1:16 1:16
КАФГА,% 4% 20% 64% 10% 45%

Таким образом, после курса терапии аппаратом "Уро-Биофон" наблюдается на первом этапе увеличение титра ГА, что приводит к увеличению комплемент активирующей функции ГА. Через три месяца после лечения титр ГА снижается до нормы, но комплемент активирующая функция постепенно после снижения 16.05.2004 г через 1,5 месяца резко увеличивается в 4,5 раза.

5. Исследование содержания и комплемент связывающей активности циркулирующих иммунных комплексов до и после воздействия аппарата "Уро-Биофон" in vivo

Циркулирующие иммунные комплексы в сыворотке крови определяли методом преципитации полиэтиленгликолем 6000 с помощью набора реагентов "Микроанализ ЦИК" (НПО "Синтеко", Москва). При концентрации ПЭГ 3,75% преципитируют "среднемолекулярные" ЦИК. В норме относительное содержание ЦИК не превышает 55 у.е. На таблице 5 представлены данные относительного уровня содержания ЦИК до и после лечения аппаратом "Уро-Биофон" и коэффициента эффекторной функции гетерофильных антител по активации системы комплемента (К ЭФГА-СК).

Таблица 5. Содержание относительного уровня ЦИК и ККАФГА до и после лечения аппаратом "Уро-Биофон"

Показатели Дата исследования
24.06.2003 24.01.2004 26.04.2004 16.05.2004 16.05.2004
Содержание ЦИК, у.е. 0 4 60 40 64
К ЭФГА-СК 0,156 0,16 0,125 0,34 1,4

После воздействия аппарата "Уро-Биофон" возрастает доля "среднемолекулярных" ЦИК, что свидетельствует о том, что при активации системы комплемента циркулирующими иммунными комплексами в меньшей степени образуются "низкомолекулярные" ЦИКи, которые обладают большим патологическим потенциалом. Повышение е К ЭФГА-СК свидетельствует об увеличении удельной активности гетерофильных антител, т.е. об увеличении способности ГА активировать комплемент.

Для более детального исследования свойств ЦИК был использован метод потребления СК ПЭГовым осадком из сыворотки крови человека. С этой целью готовили осадок при концентрации ПЭГ 7% в системе из сыворотки от 24.01.2004 г. Осадок растворяли в исходном объеме сыворотки в 0,15 М растворе NaCl и определяли потребление комплемента в сыворотках до воздействия и после воздействия аппаратом "Уро-Биофон" в условиях in vivo. В качестве источника комплемента использовали сыворотки (А) от 24.06.2003 г. и (Б) от 5.07.2004 г, то есть до лечения и после лечения аппаратом "Уро-Биофон". (Сыворотки хранились при -70оС). Результаты представлены на таблице 6.

Таблица 6. Потребление СК ПЭГ-овым осадком в сыворотках А и Б

Потребление комплемента ПЭГовым осадком, %
Концентрация ПЭГ осадка в системе, мкл 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Сыворотка А 6 12 26 49 69
Сыворотка Б 8 9 13 18 26

Таким образом, комплемент в сыворотке Б (сыворотка до лечения) в 2,7 раза хуже потребляется ПЭГовым осадком, чем комплемент в сыворотке А (после лечения). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в сыворотке после лечения повысилась аффинность субкомпонента С1q к иммуноглобулину в составе ЦИК.

5. Заключение

В результате проведенных исследований по влиянию аппарата "Уро-Биофон" на систему комплемента, комплемент активирующие свойства гетерофильных антител, уровень и комплемент потребляющее свойство циркулирующих иммунных комплексов в условиях in vitro и vivo установлено:

- после одного сеанса воздействия аппаратом "Уро-Биофон" на сыворотку крови человека наблюдается снижение активности комплемента в 2 раза и комплемент активирующей функции гетерофильных антител в 2,7 раза;

- после проведенного лечения (воздействия) аппаратом "Уро-Биофон" (30 сеансов) усиление активности системы комплемента наблюдается через один месяц, в то время как усиление комплемент активирующей функции гетерофильных антител наблюдается после недельного курса воздействия;

- после воздействия аппарата "Уро-Биофон" возрастает доля "среднемолекулярных" иммунных комплексов, которые имеют меньший патологический потенциал, чем "низкомолекулярные" ЦИК;

- после воздействия аппарата "Уро-Биофон" возрастает коэффициент эффекторной функции гетерофильных антител по системе комплемента, который характеризует комплемент активирующие свойства ГА;

- после воздействия аппарата "Уро-Биофон" возрастает аффинность субкомпонента С1q первого компонента комплемента к иммуноглобулину в составе ЦИК в 2,7 раза по сравнению с контрольной сывороткой.

Таким образом, облучение аппаратом "Уро-Биофон" сыворотки крови в условиях in vitro приводит к понижению как активности систему комплемента, так и к снижению комплемент активирующей способности гетерофильных антител, общий эффект данного воздействия свидетельствует о местном противовоспалительном действии облучения. Наиболее впечатляющие эффекты, которые наблюдаются после курсового воздействия аппарата "Уро-Биофон" на организм, характеризующиеся повышением активности системы комплемента, снижением титра гетерофильных антител и ростом его коэффициента, увеличением доли "среднемолеклярных" циркулирующих иммунных комплексов, возрастанием аффинности С1q к иммуноглобулину в составе ЦИК, свидетельствуют о воздействии ИК облучения на этиологический фактор, который оказывает иммуносупрессивный эффект. Для большей объективности полученных результатов было бы целесообразным выявление хронической инфекции у пациентов и повторные исследования через 3-6 месяцев, а так же большее количество наблюдений у больных.

6. Литература

1. Volonakis J.E., Frank M.M. The Human Complement System in Health and Disease. Mareel Dekker, New York, 1998.

2. Lambris J.D., Holers V.M. (Eds) Therapeutic Intervention in the Complement System. Humana Press, Totowa. 2000.

3. Sahu A. and Lambris J.D. Complement Inhibitors: a Resurgent Concept in Anti-inflammatory Therapeutics // Immunopharmacology. - 2000. - V. 49. - P.133-148

4. Шойбонов Б.Б., Хайбулин В.Р., Сониев В.М., Онтобоев А.Н., Зинченко А.А., Алешкин В.А. Способ определения нарушения иммунного статуса // Патент РФ на изобретение № 2002134063, приоритет от 18.12.2002.

5. Козлов Л.В., Крылова Ю.П., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5 // Биоорган. химия. 1982. Т. 8, № 5. С. 652-659


Все о Биофоне Лечение Покупка Новости Вопросы-ответы

web@biofon.ru © НПП "Бионикс" 1992-2012 г.